口袋K号22:植物疾病诊断

重要的农作物受到多种植物病虫害的威胁。这些会损害农作物,降低水果和蔬菜的质量,消灭所有的收成。世界农业总产量的42%左右每年都会受到病虫害的破坏。农民通常必须与多个害虫或疾病以及攻击同一作物的新的抗农药病原菌作斗争。

然而,作物损失可以最小化,如果植物疾病得到了正确的诊断和早期的鉴定,就可以针对特定的病原体进行特定的治疗。这些基于需求的治疗也转化为经济和环境效益。

传统的植物病原鉴定方法是通过肉眼观察。这通常只有在对作物造成严重损害后才可能发生,所以治疗将是有限的或没有用处的。为了保护植物免受病原体不可修复的损害,农民必须能够识别感染,甚至在它变得可见之前。

这有可能吗?当病原体攻击植物时会发生什么?致病生物的攻击会在植物中产生复杂的免疫反应,导致产生与植物防御和限制感染传播有关的疾病特异性蛋白质。病原体也会产生蛋白质和毒素来促进它们的感染,在疾病症状出现之前。这些分子在植物诊断试剂盒的研制中起着至关重要的作用。

分子生物学进展,植物病理学,生物技术使开发这种工具成为可能。这些试剂盒旨在早期检测植物疾病,通过鉴定植物中病原体的存在(通过检测病原体DNA)或病原体或植物在感染期间产生的分子(蛋白质)。这些技术需要最少的处理时间,并且在识别病原体方面更准确。有些人需要实验室设备和培训,其他程序可由无特殊培训的人员在现场执行。

到目前为止,诊断工具被设计用来检测水稻等农作物的疾病。土豆,番木瓜,西红柿,还有香蕉。在常规作物运输中,类似的试剂盒对于识别转基因生物(GMO)也越来越重要。

DNA诊断试剂盒

DNA诊断试剂盒基于单链核酸与其他序列互补的单链核酸(称为同源核酸)结合的能力。

DNA诊断试剂盒中使用的工具是聚合酶链反应(PCR)。聚合酶链反应涉及三个步骤。DNA首先被解开,它的股线被高温分开。随着温度的降低,短,被称为引物的单链DNA序列在同源区域与DNA链自由结合,使(taq)聚合酶产生一个新的分子拷贝。变性退火延伸率循环重复30-40次,产生数以百万计相同的片段拷贝。

PCR诊断试剂盒中的引物对病原体的基因非常特异。只有患病植物才会发生扩增。(图2)

图1:基于PCR的诊断方法

资料来源:阿尔伯茨ET.A.1994。
照片由网址:http://www.msu.edu

PCR诊断试剂盒中的引物对病原体的基因非常特异。DNA扩增只会发生在有病的植物中。(图1)

几种基于聚合酶链反应的方法已成功地应用于植物病原菌的检测。实时聚合酶链反应(RT-PCR)遵循聚合酶链反应的一般原理;其关键特征是扩增的DNA被量化,使用荧光染料,因为它在每个循环后都会在反应混合物中聚集。它比普通的聚合酶链反应有几个优点,包括:降低样品污染的风险,实时提供数据,同时检测多种病原体。实时PCR协议是目前最快速的物种特异性检测技术之一。

DNA微阵列也可以用于同时检测病原体。这很重要,由于植物经常感染几种病原体,其中一些可能共同导致疾病复杂。微阵列由固定在固体表面的病原体特异性DNA序列组成。样品DNA经PCR扩增,用荧光染料标记,然后与阵列混合(图2)。

图2:DNA微阵列

资料来源:阿尔伯茨ET.A.1994。
照片由网址:http://www.msu.edu

与其他技术相比,基于PCR的诊断非常敏感;检测少量的DNA是可能的。PCR还可以帮助农民检测在感染和症状发展之间存在较长潜伏期的病原体。此外,它可以量化宿主组织和环境样本中的病原体生物量,同时检测杀菌剂抗性。基于PCR的检测,然而,与基于蛋白质的诊断方法相比是昂贵的,而且还需要昂贵的设备。

到目前为止,已经开发了用于检测香蕉中的黑葡萄球菌病的PCR试剂盒。马铃薯疫霉病,棉花镰刀菌感染。

蛋白质诊断试剂盒

防御反应的第一步是由宿主的免疫系统识别入侵者。这种识别是由于特定宿主蛋白的能力,称为抗体,识别并结合病原体(抗原)特有的蛋白质并触发免疫反应(图3a)。

图3:抗体-抗原相互作用

AlbertsET.铝。1994。

以蛋白质为基础的植物疾病诊断试剂盒含有一种抗体(原抗体),该抗体既可以识别病原体中的蛋白质,也可以识别患病植物中的蛋白质。因为抗体抗原复合物肉眼看不见,诊断试剂盒还含有二级抗体,它与一种酶结合。这种酶会催化一种化学反应,这种化学反应只有当原抗体与抗原结合时才会导致颜色变化。因此,如果试剂盒的反应混合物发生颜色变化,然后植物病原体出现了,(图3b)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)法利用该检测系统,构成了一些蛋白质诊断试剂盒的基础。酶联免疫吸附测定试剂盒非常容易使用,因为测试只需要几分钟的时间,不需要复杂的实验室设备或培训。
目前市场上已经有大量的酶联免疫吸附试验试剂盒。其中一些检测到了根类作物的疾病(例如木薯,甜菜,土豆),观赏植物(例如百合花,兰花)水果(例如香蕉,苹果,葡萄)颗粒(例如小麦,大米)还有蔬菜。酶联免疫吸附试验能检测甘蔗宿根矮化病。番茄花叶病毒,木瓜环斑病毒,香蕉苞叶花叶病毒,香蕉束顶病毒,西瓜花叶病毒,还有水稻通格罗病毒。

国际马铃薯中心(CIP)开发的第一批用于诊断植物疾病的酶联免疫吸附测定试剂盒之一。它能探测到所有种族的存在,Bivivar,以及青枯菌的血清型,引起马铃薯青枯病或褐腐病的病原体。他们还开发了一种试剂盒,用于检测是否存在下列任何一种甘薯病毒:SPFMV(甘薯羽毛斑驳病毒)。Spcsv(甘薯绿矮化海百合)SPMSV(甘薯温和斑点病毒)SPMMV(甘薯轻度斑驳病毒)SWPLV(甘薯潜伏病毒)SPCFV(甜食氯斑点病毒)spcalv(甘薯茎状病毒)和C-6(新的弯曲杆状病毒)。

结论

随着分子生物学和免疫学的进一步发展,科学家和农民将能够提高对植物疾病的诊断。已经在努力生产更好的诊断试剂盒,以检测对发展中国家重要的作物中的病原体。例如,印度科技部生物技术部正在开发诊断试剂盒来检测水果中的病毒,观赏植物,香料,种植作物。埃及农业基因工程研究所的基因工程服务部门已经开发了诊断工具和检测服务来检测农作物中的病毒。

诊断工具是一种投资:它们可能很昂贵,但是成本可以用收益来抵消,例如减少作物损失和更环保的作物管理做法。发展中国家的公共部门和私营部门都应该把发展作为优先事项。

词汇表

抗体:免疫系统对病原体攻击产生的蛋白质。
抗原:一种与活体无关的物质,刺激抗体的产生。抗原包括蛋白质,细菌,病毒。
ELISA:酶联免疫吸附试验,检测抗原或抗体的试验。
聚合酶链反应:聚合酶链反应,DNA复制后的技术模式,在那里生产了数百万份DNA片段的拷贝,使DNA片段更容易分离,克隆,和顺序。
底漆简言之,设计为与基因组某一区域互补的单链DNA片段。引物作为PCR的起点。

工具书类

AlbertsET.铝。细胞的分子生物学。第四版。1994。
http://www.cipotato.org/market/ars/ar98/inbrief.htm(网址:http://www.cipotato.org/market/ars/ar98/inbrief.htm)
http://www.agriculture.gov.bb/files/sweet%20potato%20paper.pdf

*2008年10月

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