口袋K。36:无标记的转基因植物

介绍

选择标记基因对转基因作物的研究和开发至关重要。在植物细胞中导入外源DNA的方法,或者通过显微注射,粒子枪,电穿孔或土壤杆菌属,相对低效。在未转化的细胞海洋中成功整合外源DNA的细胞,就像大海捞针。为了寻找转基因细胞,标记基因与感兴趣的基因共同引入。这些显性基因赋予抗生素耐药性,如潮霉素(hpt)和卡那霉素(nptII),和除草剂,如phosphinothricin(酒吧)和chlorosulfuron(肌萎缩性侧索硬化症),杀死未转化的细胞。然而,在成熟植物中可能不需要抗生素和除草剂抗性标记基因,尤其是当它们在田间种植时。

这些标记基因在商品化转基因作物中的存在引起了公众对转基因食品消费和转基因作物栽培的医学意义的相当关注。抗除草剂基因可能通过外交转移到野生杂草和作物的亲戚。也存在这种可能性,尽管极其罕见,从转基因植物向土壤和肠道微生物的水平基因转移,导致病原体对抗生素目前正在使用无效。然而,到目前为止,目前使用的抗生素标记物对人体或动物健康构成危险,但尚无实验证明。

不是所有的科学家都同意这些说法。证明标记基因确实无害的难度已经大大限制了公众对农业生物技术.

很多研究工作已指向的发展不需要转换方法和选择标记消除策略。除了减少公共问题,缺乏抗性基因在转基因植物发展转基因产品也可以降低成本,减少需要耗时的安全评估,从而加快了新产品的商业发布。无标记植物的产生同样支持单系再转化,对多种病原体的抗性和对非生物胁迫的耐受性等复杂性状的多基因导入的重要途径。

有几种方法可以避免或摆脱可选择的标记基因。方法将允许在植物有效的DNA插入的方法已被开发,如使用位点特异性重组,转位和同源重组。研究人员还描述了几种没有有害生物活性的替代标记基因。指出这些无菌基因的存在使得植物代谢无毒代理通常对他们有害。

替代抗生素或除草剂抗性标记

科学家们已经鉴定出阳性的可选择的标记基因,这些基因依赖于无毒物质,这些物质可能是细胞生长的基础或诱导转化的细胞或组织的生长。这些可选择的标记物仅抑制未转化细胞的生长,与抗生素和除草剂抗性标记相反。

例如,转基因事件可以使用标记物来选择,标记物使得转基因事件能够使用特定的食物来源。这种方法的一个例子是使用phosphomannose异构酶基因(采购经理人指数)成功结合外源DNA的细胞能够被鉴定,因为它们能够利用甘露糖作为其唯一的食物来源。PMI已被用作许多植物物种转化的可选择标记,包括大米、小麦,小米,烟草,甘蔗,苹果和洋葱。其他依靠植物细胞在特定糖或糖醇存在下生长作为其唯一能源的选择系统包括xylA(木糖),ATL语言D(阿拉伯醇)和ATPS1(葡萄糖)。基因,使植物在媒体生存提供分子氨基酸类似物和酸,如TSB1ASA2(色氨酸),,TD(异亮氨酸)和DAO1(分子酸),也用于鉴定转化细胞。

使用替代标记完全消除了对抗生素和除草剂抗性基因可能扩散到环境中的担忧。然而,由于这些标记物需要引入新的代谢途径,因此需要更严格的风险评估来建立转基因产品的安全性。

研究人员也使用可见标记使转基因植物视觉辨认。绿色荧光蛋白(GFP)的水母基因使转基因植物细胞在紫外光照射下呈现绿色。报道基因如萤火虫蛋白荧光素酶和植物的红紫色花青素同样被用作选择稳定转化的细胞谱系的可见标记。这种方法的一个主要缺点,然而,细胞转化和非转换后必须手动分开,这可能非常单调和耗时。

传统遗传学:共转化

尽管许多替代标记的存在,完全去除选择标记可能更有利的长远来看,因为它很有可能未来的监管立法将强烈支持没有多余的转基因作物转基因材料。

最简单的一个标记删除策略是互相转化的方法。的原则整合的策略是兴趣和标记基因的转基因在植物基因组中不同的链接位置及其后续隔离下一代产生后代携带转基因而不是标记。三种方法被用于共转化:(i)引入两个不同农杆菌属菌株都有一个变换向量,一个携带标记基因,另一个携带靶基因,(ii)使用一株携带两个载体的细菌菌株,每个都有一个基因,和(3)使用菌株窝藏一个向量,两个基因位于不同的位点。

共转化可以方便地集成到现有的转换协议。它已被成功地用于消除几种作物中可选择的标记基因,变换频率高达85%。然而,自从种族隔离的方法依赖于基因在有性生殖过程中,它不能被用于植物超低温保存。选择只携带目标基因的后代也可能是费力的,因为从统计学上讲,所期望的性状组合只能在16个后代中找到一个。

分子剪切与粘贴:位点特异性重组

微生物网站具体可也被用于消除不必要的标记的转基因作物。这些酶起着分子剪刀的作用,能够在特定位点裂解DNA。他们还可以作为分子胶水,以第二靶序列连接切割的DNA片段。介绍了编码这些酶的基因和标记基因,其两侧是酶可识别的回文序列,以及感兴趣的基因。转化细胞一旦被选中,重组酶基因可以通过外部刺激被激活。然后可去掉标记基因和酶的基因,所以由此产生的植物没有任何可选的标记。

有三个特定站点描述复合系统,已成功地用于删除标记基因,使用最广泛的是Cre /洛克斯普系统从噬菌体P1(见图)。两个之间的Cre重组酶催化反应洛克斯普序列和结果之间的DNA片段的切除。Cre重组酶基因引入转基因植物通过re-transformation繁殖或诱导性自体切除。autoexcision策略是一个一步的过程,依靠chemically-inducible启动子基因激活。几个实验证明了这种方法的优点相比re-transformation和跨越。

赖氨酸强化转基因玉米LY038,其中,标记基因已经在Cre-lox系统的帮助下被去除,已经批准种植在加拿大,日本和美国以及澳大利亚的食物和饲料用途,墨西哥和菲律宾。

跳沿染色体:通过转座子标记删除

使某些基因在植物基因组上的某个位置“跳跃”的过程也可以用来产生无标记的植物。这种方法类似于特定场地重组,仅此而非重组酶和识别位点,使用转座子或跳跃基因。转座子含有一种特殊的酶的基因,在DNA识别某些信号。这种酶切割这些信号旁的DNA片段,并将它们随机整合到基因组中。最具特征的转座子是Ac/Ds家族的转座子,这是首次在玉米中发现的,特殊酶的Ac(活化剂)转座酶和Ds(分离器)序列标记信号。

感兴趣的基因或标记基因可以置于“跳跃”序列中,通过转座酶的激活,两个基因可以相互分离。虽然该系统已被证明是有效的,通过这种策略去除标记的效率很差,由于发病率低。这种方法也可能是耗时的,因为分离感兴趣的基因和标记基因需要育种或分离。

未来展望

大量的方法来消除抗生素和除草剂标记已经发展在过去的几年中,进一步改进正在进行中。最近,研究人员已经描述了消除重组位点残留识别序列的方法。这可能增加位点特异性重组作为去除不需要的DNA序列的选择工具的吸引力。科学家们还在寻找在共转化或转座后加速选择无标记后代的方法。报道了基因打靶和同源重组的新标记消除策略。这些发展,担心抗生素和除草剂抗性基因在环境中不受控制地传播可能在未来变得无关紧要。

锌指核酸酶的应用也取得了一些进展,它们在去除转基因方面的潜力以及在靶向基因置换中的应用前景广阔。

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