口袋K。54:植物育种创新:CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9系统是利用定点导向的核酸酶对DNA进行精确定位和修饰的植物育种创新。1,2来自加州大学的科学家在2012年形成的,伯克利分校CRISPR-Cas9近年来获得了广泛的关注,由于其应用范围,包括生物学研究,农业作物和动物的育种和发展,和人类健康应用程序。1,2这些包括基因沉默,无DNA CRISPR-Cas9基因编辑同源定向修复(HDR),和瞬态基因沉默或转录镇压(CRISPRi)。1,三,4,5

什么是CRISPR及其工作原理

CRISPR,定期或集群空间短回文的重复,是细菌防御系统的组成部分。这也是CRISPR-Cas9系统的基础。1,2,三,5

CRISPR分子由短回文DNA序列组成,这些序列沿着分子重复,并有规则间隔。这些序列之间”逆电流器”,外国的DNA序列生物曾袭击了细菌。CRISPR分子还包括CRISPR-associated基因,或Cas基因。这些编码蛋白的DNA解旋,切割DNA,解旋酶和核酸酶,分别。1,6

CRISPR免疫系统通过三个步骤保护细菌免受反复的病毒攻击:

1。适应,当DNA病毒入侵的细菌,病毒DNA加工成一小段一小段,制成一个新的重复之间的间隔。这些将作为先前感染的遗传记忆。

2。CRISPR RNA的产生——CRISPR序列进行转录,包括间隔子和Cas基因,创建一个单链RNA。产生的单链RNA称为CRISPR RNA,在它的间隔物中含有入侵病毒DNA序列的副本。

三。靶向性——CRISPRRNA将识别病毒DNA并引导CRISPR相关蛋白到达它们。然后蛋白质裂解和摧毁目标病毒材料。

图1。CRISPR介导的免疫步骤6

科学家利用CRISPR-Cas9系统对特定DNA序列的识别,并将其应用于改良作物的开发过程中。而不是病毒DNA作为定位器,科学家们设计他们自己的序列,基于他们感兴趣的特定基因。如果一个基因的序列已知,它很容易在CRISPR中使用。然后它将像系统的间隔物一样起作用,引导Cas9蛋白进入DNA匹配序列。1,6


图2。基因编辑CRISPR / Cas96的机制

CRISPR-Cas9允许研究人员执行以下:

基因敲除
利用CRISPR进行基因沉默始于使用单导RNA(sgRNA)靶向基因,并使用Cas9内切酶启动双链断裂。这些断裂然后通过先天的DNA修复机制修复,非同源末端连接(NHEJ)。然而,NHEJ容易出错,导致基因组缺失或插入,然后转化为永久的目标基因的沉默。4,7,八

无DNA基因编辑
CRISPR已经没有DNA可以用于细胞DNA基因编辑不使用向量,只需要RNA或蛋白质组分。已经没有DNA的细胞基因编辑系统可以是一个不错的选择,以避免不良的基因改变的可能性由于切的质粒DNA整合网站或随机向量集成。4,七

基因插入或敲入“”
CRISPR-induced双链断裂也可以用来创建一个基因”敲门声利用细胞的同源定向修复。供体模板的精确插入可以改变基因的编码区域。以前的研究已经证明,单链DNA可以用CRISPR-Cas9系统产生精确的插入。4,7,八

瞬态基因沉默
通过修饰Cas9蛋白使其不能切割DNA,也可以进行短暂的基因沉默或转录抑制。改进的Cas9,由导游RNA,目标基因的启动子区域,减少转录活性和基因表达。特异性基因的瞬时激活或上调可以有效地进行。4,七

CRISPR——Cas9应用程序

研究人员发现,CRISPR-Cas9系统可以应用于几乎所有生物体。利用CRISPR-Cas9进行基因编辑的早期研究集中在对农业重要的作物上。早就意识到,该系统可用于农作物改善品质,如产量,植物建筑,植物美学,和疾病的宽容。

CRISPR被用来编辑水稻的基因组。应王的团队先正达生物技术中国设计几个CRISPR sgRNAs并成功删除的片段密度和竖立panicle1(DEP1籼稻线IR58025B)基因。改进
在产量相关性状中,如密度和直立穗数和株高降低,观察产生的变异植物。9

蔡玉鹏领导的中国农业科学院的研究小组还利用CRISPR-Cas9系统诱导GMFT2A,大豆光周期开花途径中的整合子。已开发的大豆植株开花较晚,导致增加营养的大小。稳定遗传的突变被发现在以下一代。

北京蔬菜种质改良重点实验室,以田守伟为首的CRISP-Cas9为靶CPLD,西瓜植酮脱饱和酶实现白化表现型。所有genome-edited西瓜存在突变CPLD并显示完整的或镶嵌的白化表型。本研究为CRISPR-Cas9系统在西瓜育种中的应用提供了理论依据。十一

中国农业科学院研究人员和国家柑橘品种改良中心和西南大学也开发柑橘类植物对柑橘溃疡病所致柑橘溃疡病无性系种群。柑橘属植物(Xcc),柑橘的严重疾病,通过CRISPR-Cas9。

团队目标的启动子CsLOB1基因,促进柑橘溃疡病的发生。与野生型相比,所育系对柑桔溃疡病的抗性增强。12

冷泉港实验室与各种研究机构一起,还用CRISPR-Cas9在抑花剂中产生突变SELF-PRUNING5G(SP5G茄操纵光周期反应。)CRISPR-Cas9诱变使大田番茄开花迅速,生长习性增强,使花产量迅速爆发并早产。13

CRISPR-Cas9还允许产生适合人类疾病建模的动物。来自云南省灵长类生物医学研究重点实验室的牛玉玉玉玉(Yuyu Niu)研究小组通过将Cas9 mRNA和sgRNA共注入单细胞期胚胎来应用CRISPR-Cas9。研究小组培育出CRISPR编辑的食蟹猴,用于治疗小鼠无法完全研究的大脑疾病。十四

来自加利福尼亚大学的研究人员也使用CRISPR基因治疗的研究。使用CRISPR-Cas9,他们纠正突变与基因相关疾病,通过从β地中海贫血患者中产生诱导多能干细胞(iPSCs)来治疗β地中海贫血。该团队使用CRISPR-Cas9纠正突变在人类血红蛋白β(HBB)病人万能,导致基因校正的iPSCs恢复HBB基因的表达,可用于基因治疗。十五

美国科学家也在研究CRISPR在治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)中的应用。他们利用CRISPR从免疫细胞中编辑出HIV基因组,称为T细胞,来自HIV患者。科学家发现,CRISPR可以促使HIV病毒变异。然而,在CRISPR可用于治疗HIV之前,还需要更多的研究。6

CRISPR近年来在基因组编辑研究的增长中发挥了巨大的作用。系统已经广泛应用在植物和动物的改进,以及在医学领域。作为一种相对年轻的技术,为了在更广泛的应用中有效地使用它,各种发现和创新正在进行中。

工具书类

  1. BarrangouR。FremauxC。Deveau,H.理查兹M。博伊瓦尔P.Moineau,S.罗梅罗D.A.和阅读P.2007。CRISPR提供对原核生物中病毒的获得性抗性。科学》315(5819):1709 - 1712。
  2. 地平线上的发现。2016。CRISPR / CRISPR Cas9。https://www.horizondiscovery.com/gene-编辑/ crispr.
  3. Bolotin一个,Quinquis,B.,索罗金一个,埃尔利希,S.D.2005.定期聚集空间短回文重复序列(CRISPRs)间距器染色体外的来源。微生物学151(8):2551-2561。
  4. Dharmacon。2016。基因编辑。http://d.acon.gelifesciences.com/application/.-editing/.
  5. Jinek,M。ChylinskiK。Fonfara我。,HauerM。DoudnaJ.A.和贝纳e.2012.一种适应性细菌免疫中的可编程双RNA引导的DNA内切酶。科学337(6096):816-821。
  6. 哈佛大学。2015.CRISPR:一种改变游戏规则的基因工程技术。http://sitn.hms.harvard.edu/flash/2014/crispr-a-.-change-.-.-./.
  7. Congl跑,范围内,CoxD。林S.巴雷托R。HabibN.Hsu申先生,吴,X。江W.玛拉芬尼,L.A.张F。2013.多路复用基因组工程使用CRISPR / Cas系统。科学339(6121):819-823。
  8. AddGene。2014.历史与背景。https://www.add..org/crispr/././.
  9. 王Y。耿,l袁M。世界环境学会,J。,Jin C.李,M。Yu K.张Y。,靳H.王e.柴Z。傅X。李,X。2017.利用CRISPR/Cas9技术删除籼稻靶基因植物细胞报告36(8):1333 - 1343。
  10. 蔡Y。陈l线路接口单元,X。郭C。太阳,S.吴,C。江B.,汉T。侯,W2017.CRISPR/Cas9介导的GMFT2A延缓大豆开花时间。植物生物技术杂志》上。http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12758/full.
  11. 田,S.江l高问。张,J。,宗庆后,M。张,H.任Y。郭S.龚G.线路接口单元,F。徐,Y。2016。西瓜中有效的CRISPR/Cas9基因敲除。植物细胞报告36(3):399-406。
  12. 彭,一个,陈S.雷T。徐,l他,Y。吴,l姚明,l邹X。2017.利用CRISPR/Cas9靶向编辑抗溃疡病基因CsLOB1柑橘中的启动子。植物生物技术杂志》上。http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12733/..
  13. Soyk,S.穆勒,N.A.公园,S.J。Schmalenbach,我。,江K。Hayama,R。张,lVan Eck,J。,Jimenez-Gomez,赵硕,,和里普曼,如2017.开花基因的变异自练5G促进番茄的日中性和早期产量。自然遗传学,49(1):162-168。
  14. 牛一,沈B。Cui Y.陈Y。王J。,Wang L.Kang Y.Zhao X.Si W.李W。项Zhou J.郭X。Bi Y.Si C.Hu B.Dong G.Wang H.Zhou Z.Li T.谭T。聚氨酯X。Wang F.霁。,周问。黄X。霁W。,沙杰2014.Cas9/RNA介导的单细胞胚胎靶向基因修饰食蟹猴细胞156(4):836-843
  15. Xie F.你们L。Chang李鸿源。拜耳A.I.王J。,Muench秘诀。和菅直人陈怡如2014.无缝基因修正beta-thalassemia突变患者则使用CRISPR / Cas9 piggyBac。基因组研究24(9):1526-1533。

下一袋K:生物技术改良动物